ВЕТЕРИНАРНЫЕ ПРЕПАРАТЫНарушения в абдоминальной верхушке яйца вызванных MYCOPLASMA SYNOVIAE.
1.Служба Охраны Здоровья Животных (GD), почтовый ящик 9, 7400, AA, Девентер, Нидерланды.
2.Факультет Ветеринарии, Отделение здоровья домашнего скота, Утрехтский университет, Ялелан 7, 3584, CL, Утрехт, Нидерланды.
Неизвестная патология яичной скорлупы, характеризующаяся изменением структуры скорлупы, утончением, увеличением прозрачности, трещинами и проломами в верхней части скорлупки яйца, стала все более распространенной среди несушек различных пород в Нидерландах.
Два полевых исследования обнаружили связь между нарушением скорлупы в верхней части яйца (EAA) и заражением Mycoplasma synoviae. M. synoviae был выделен из яйцевода птиц, которые откладывали яйца с нарушениями, у птиц из контрольной стаи такой инфекции обнаружено не было, хотя как у зараженных птиц, так и у птиц из группы контроля, были обнаружены антитела к M. synoviae. После разовой инъекции окситетрациклина длительного действия, производство яиц с нарушениями прекратилось, но затем снова появилось примерно через 12 дней. Случайная связь между EAA и заражением M. synoviae после была доказана при помощи эксперимента. EAA наблюдалось после внутритрахеального заражения птиц M. synoviae, и еще чаще у птиц зараженных инфекционным бронхитом за пять дней до прививки M. synoviae. EAA также встречалось, хотя менее часто, у птиц, которым M. synoviae был введен внутривенно и которые были заражены вирусом инфекционного бронхита.
EAA не наблюдалось у птиц, которым было привито только M. synoviae внутривенно. M. synoviae был выделен только из яйцеводов птиц, несших яйца с нарушениями. Среднее дневное производство яиц было снижено у всех групп, зараженных M. synoviae. Исследование яичной скорлупы сканирующей электронной микроскопией выявило, что мамиллярный слой отверделого участка отсутствовал и, что внутренние мембраны скорлупы были утолщены. Изоляты M. synoviae из яйцеводов птиц с ферм производящих яйца с нарушениями были исследованы при помощи расширенного анализа полиморфизма длины амплификационных фрагментов и не представлялись клональными.
Введение:
Mycoplasma synoviae считается второй основной микоплазмой, которой подвержены куры. (Stipkovits &Kempf, 1996; Kleven, 2003). Она вызывает респираторные заболевания и последующие отклонения тушек в связи с аэросаккулитом, хотя большинство респираторных заболеваний представляются бессимптомными.
M. synoviae также вызывает синовит у кур и индеек (Landman & Feberwee, 2001, 2004; Kleven, 2003). Действие инфекции M. synoviae на кладку яиц остается неопределенным. В одном отчете общее уменьшение кладки составило 10% в стаях зараженных M. synoviae (Morrow и другие, 1990), а в другом исследовании между заражением M. synoviae и кладкой яиц связи обнаружено не было (Mohammed и другие, 1987). Тем не менее стаи несушек, зараженные штаммами артропатии M. synoviae могут страдать от значительных потерь в связи с задержкой роста и выбраковкой хромых птиц (Landman & Feberwee 2001; van Beek и другие, 2002). С 2000г аномалии верхней части скорлупы яиц (EAA) все чаше встречались в стаях несушек в Нидерландах. EAA характеризуется шероховатой поверхностью скорлупы, утончением скорлупы, увеличением прозрачности, трещинами и проломами. Нарушения поражающие верхнюю часть скорлупы яйца, располагаются в районе примерно до 2 см от верхушки, и граница этого участка яйца, как правило, достаточно четко ограничена. Процент яиц с отклонениями варьируется в различных стаях, oт нескольких процентов до 25%. После появления, яйца с нарушениями откладываются в течение всего оставшегося периода яйцекладки. Материальные последствия, связанные с повреждением скорлупы, схожи с явлением дефективных верхушек скорлупок. EAA первоначально было обнаружено у белых несушек, размещенных в клетках, но позже также было замечено у коричневых несушек, также размещенных в клетках, и у обеих разновидностей размещенных иным способом.
Целью описанной здесь работы являлось определить, существует ли связь между заражением M. synoviae и кладкой яиц с нарушениями.
Изначально были проведены два полевых исследования для определения этой связи. За тем, случайность связи между заражением яйцевода M. synoviae и EAA была изучена путем экспериментального заражения птиц M. synoviae.
Материалы и методы:
Полевые исследования.
Полевое исследование 1. Три стаи белых несушек, размещенных в клетках на разных фермах производящих яйца с EAA были исследованы. Процент яиц с EAA на этих трех фермах составлял 3%, 10% и 25%, соответственно. Другие три стаи (одна стая белых несушек, и две коричневых, живущих на земле) у которых были обнаружены агглютинирующие антитела против M. synoviae, но которые не несли яиц с нарушениями, также были включены в исследование. От трех до шести птиц из каждой стаи были исследованы. В стае несущей яйца с EAA, были обследованы только несушки, которые несли яйца с нарушениями. Цыплята были «оглушены» углекислым газом и кислородом, обескровлены через яремную вену и макроскопически исследованы. Сыворотка была собрана для серологии M. synoviae и были взяты мазки из яйцеводов для общей бактериологии и выращивания микоплазмы. Дополнительно, ДНК был получен из культуры M. synoviae молекулярного типирования.
Полевое исследование 2 (пробы лечения). Второе лонгитюдное исследование проводилось в течение 7 недель на другой зараженной стае сорок белых несушек в возрасте 70 недель несущих яйца с EAA были размещены в индивидуальных клетках на ферме. Через три недели после начала исследования (W3), 20 из этих птиц была разово подкожно введена доза 100мг окситетрациклина длительного действия (Terramycin/LA; Pfizer, Capelle ad IJssel, Нидерланды). Стая несушек, серологически положительных на инфицирование M. synoviae, но при этом не откладывающая яиц с отклонениями, была включена в исследование как контрольная группа. Птицы из группы контроля были на три недели моложе зараженных. Птицы на обеих фермах были привиты от вируса атипичной чумы птиц, вируса инфекционного бронхита (IBV) и птичьего постпневмонического вируса, и были серологически отрицательными по вирусу птичьего гриппа, Mycoplasma gallisepticum и аденовирусу синдрома снижения яйценоскости (EDS).
Образцы крови для серологии M. synoviae были взяты в день 0 (D0), неделю 3 (W3), неделю 4 (W4) и неделю 7 (W7) исследования. На 7 неделе, образцы крови, также были взяты с контрольной фермы для проведения серологии на M. synoviae. На 4 неделе, 10 птиц получивших лекарство и 10 не получивших были умерщвлены. На 7 неделе были умерщвлены остальные птицы. Десять птиц, происходящих с зараженной фермы, но не несущих яиц с EAA были использованы как контрольные, также как 10 птиц примерно такого же возраста с контрольной фермы. Цыплята были «оглушены» как описано выше, обескровлены, подвергнуты макросокпическому осмотру, сыворотка была собрана для серологии M. synoviae, и мазки были взяты из яйцеводов для общей бактериологии и разведения микоплазмы.
Кладка яиц с EAA, яиц без скорлупы и разбитых яиц, ежедневно записывалась фермером в течение 7 недель. Качество яиц (толщина белка, единицы ХАО и прочность скорлупы) определялась на 3 неделе (перед проведением лечения), 4 и 7 неделе (после проведения лечения) до 19 яиц от птиц не получающих лечения и до 19 яиц от птиц получающих лечение. Качество яиц было также определено на 3, 4 и 7 неделе, до 20 яиц с контрольной фермы.
ДНК культур M. synoviae было получено для молекулярного типирования.
Скорлупа одного неповрежденного яйца и одного яйца с EAA были исследованы сканирующей электронной микроскопией (SEM).
Исследование с экспериментальным заражением.
Коммерческие белые молодки-несушки в возрасте семи недель, серологически отрицательные по аденовирусу EDS, птичьему гриппу, M. gallisepticum и M. synoviae были взяты с птицефермы. Они были дважды привиты от IBV (в день 1 штаммом вакцины типа Massachusetts через спрей, и в день 14 вакциной типа 793B через спрей) и от атипичной чумы птиц (в дни 7 и 28 спреем), и затем против инфекционного заболевания синовиальной сумки (в день 10). Все птицы были размещены вместе в загоне на настиле до возраста 16 недель. Затем птицы были взвешены, разделены не весовые категории, разделены на 5 экспериментальных групп и оставлены для акклиматизации на 2 недели.
Каждая группа была размещена в отдельный изолятор с давлением ниже атмосферного и HEPA-фильтрами (194 см шириной, 95 см высотой и 75 см глубиной; Beyer & Eggelaar, Утрехт, Нидерланды) в каждом было по четыре гнезда для несушек.
Температура варьировалась от 18ºC до 20ºC и птицы получали 14 часов света в день, пища и вода предоставлялась без ограничения.
Изолят M. synoviae (куриный/NL/Dev/SP255/Tom/05) полученный из яйцевода птицы с фермы 3 из полевого исследования 1 и выращенный в питательном растворе Mycoplasma Experience (ME) (Mycoplasma Experience, Reigate, Сюррей, Соединенное Королевство) и штамм IBV D1466, выращенный в аллантоидной полости яйца с развивающимся эмбрионом, были использованы для экспериментального заражения. Пять экспериментальных групп включали: группу отрицательного контроля (n=12) внутривенно зараженную (вв) 2 мл ME broth; группу M. synoviae вв зараженную 2 мл раствора содержащего 106 колониеобразующих единиц (CFU) M. synoviae/мл (n=18); M. synoviae вв/IBV группу зараженную через трахею (i.t.) 1 мл и внутримышечно 0.5 мл аллантоисной жидкости содержащей 106.6 средней яичной инфекционной дозы IBV/мл, за тем 5 дней спустя зараженной вв 2 мл раствора содержащего 106 колониеобразующих единиц M. synoviae/мл (n=17); группу M. synoviae зараженную через трахею 1 мл раствора содержащего 106 колониеобразующих единиц M. synoviae (n=18); и группу M. synoviae зараженную через трахею/IBV 1 мл и внутримышечно 0.5 мл аллантоисной жидкости содержащей 106.6 средней яичной инфекционной дозы IBV/мл, за тем, через 5 дней зараженную через трахею 1 мл раствора содержащего 106 колониеобразующих единиц M. synoviae/мл (n=17).
Образцы крови на M. synoviae и IBV серологию были взяты у отдельных цыплят в день 0 (только IBV-зараженная группа), неделя 4, неделя 8 и неделя 11. Цыплята также были проверены на присутствие антител против EDS аденовируса и M. gallisepticum, в день 0 и неделю 11 птицы были индивидуально взвешены.
На 11 неделе все птицы были «оглушены», обескровлены, как описано выше, в то время, когда затвердевшие яйца должны были находиться в матке (между 10:00 утра и полднем). Сыворотка была собрана для M. synoviae серологии, и мазки были взяты из яйцеводов и использованы для общего бактериологического анализа и выращивания микоплазмы.
Была проведена гистология секций яйцевода трех кур, несущих яйца с EAA и трех кур из группы отрицательного контроля.
Прочность скорлупы замерялась с 4 по 6 и с 9 по 11 недели при помощи устройства компрессии скорлупы На 4 неделе, 60 нормальных яиц полученных от группы контроля, 60 нормальных яиц от инфицированных групп, откладывающих яйца с EAA и 60 яиц с EAA от инфицированных групп были протестированы. С недели 9 по неделю 11, 30 нормальных яиц из группы контроля и от каждой из зараженных групп (n=150) и 30 яиц с EAA от зараженных групп были протестированы.
ДНК полученный из культуры M. synoviae был использован для молекулярного типирования, и над скорлупой одного нормального яйца и одного яйца с ЕАА была выполнена сканирующая электронная микроскопия.
Серология.
Сыворотки антител против M. synoviae были определены с использованием быстрой реакции агглютинации на пластинке (RPA). Сыворотки были проверены в течение 24часов после получения образцов крови. Разведенные в два раза сыворотки были проверены при помощи антигена RPA (Nobilis MS антиген номера партий 74074A и A012A01; Intervet International, Боксмеер, Нидерланды) как описано Feberwee и другими (2005). Чувствительность и специфичность обеих партий была определена перед использованием по стандартизованному набору сывороток, следуя международному стандарту ISO/IEC 17025 (2005).
Положительные сыворотки за тем были последовательно разведены от 1:4 до 1:32 в буферизованном физиологическом растворе с фосфатным буфером (8 г NaCl, 0.2 г KCl, 0.27 г KH2PO4 и 1.16 г Na2HPO4 2H2O на литр, pH 7.2) и проведено повторное тестирование. Агглютинация при разведении 1:8 или выше считалась специфической для M. synoviae.
Антитела сыворотки против M. gallisepticum были обнаружены при помощи RPA теста (Nobilis MG antigen; Intervet International) и тестом подавления гемагглютинации (HI) как описано Feberwee и другими (2005).
Агглютинация и HI при разведении 1:2 или менее считались отрицательными.
Антитела против IBV и EDS аденовируса были определены, используя тест HI (Alexander & Chettle 1977), и антитела против птичьего гриппа при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (FlockChek AIV Набор для теста на антитела, IDEXX Corporation, Вэстбрук, Маин, США) как описано De Wit и другими (1997, 2004 a,b).
Бактериальная культура репродуктивного тракта.
Внешняя поверхность яйцевода была прижжена горячим лезвием скальпеля, за тем было сделано рассечение стерильным скальпелем и две стерильные хлопковые палочки использованы для взятия мазка перешейка и матки. Один мазок был использован для разведения в чашке с 5% овечьим кровяным агаром, и другой для ME чашке с агаровой средой микоплазмы (Mycoplasma Experience). Агаровые чашки ME были размещены при температуре 37ºC во влажной среде и исследованы на колонии каждые 2 – 3 дня до 28 дней.
Одна выделенная колония была перемещена на свежий агар ME и образец размером 2х0.5 см2 колонии микоплазмы содержащей агар был перенесен в 5 мл питательного раствора ME и разведен при температуре 37ºC.
Положительные культуры микоплазмы были идентифицированы как M. synoviae при помощи цепной реакции полимераза (PCR). В полевом исследовании 1, одна культура на ферму была исследована для подтверждения того, что она является M. synoviae; в полевом исследовании 2, пять культур от птиц производящих яйца с нарушениями, которые были пролечены окситетрациклином, четыре культуры от птиц несущих яйца с нарушениями, которые не были пролечены окситетрациклином и две культуры от контрольной группы птиц, которые не несли яйца с нарушениями, были исследованы для подтверждения того, что они являются M. synoviae и в исследовании с экспериментальным заражением, одна или две положительных культуры яйцевода из каждой группы были исследованы.
Молекулярная инфекция.
Положительные бульонные культуры были гранулированы в течение 10 минут при 16 000хg, и гранулы были повторно растворены в 200 мл стерильного физиологического раствора с фосфатным буфером. ДНК был получен при помощи мини комплекта QiaAmp DNA (Qiagen Benelux B.V., Venlo, Нидерланды) с использованием протокола для искусственно выращенных животных клеток, предоставляемым вместе с комплектами (Mekkes & Feberwee, 2005). В качестве праймера для идентификации M. Gallisepticum количественной полимеразной цепной реакции был 5’-GAG CTA ATC TGT AAA GTTGGT C-3 в качестве праймера с обратной транскрипцией был использован 5’-GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC-3’ (Lauerman, 1998). Эти праймеры расширяют 186-фрагмент пары оснований 16S гена рибосомной РНК M. gallisepticum. Для проведения M. synoviae количественной полимеразной цепной реакции в качестве праймера был использован 5’-GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC A-3’ в качестве праймера с обратной транскрипцией был использован 5’-CAG TCG TCTCCG AAG TTA ACA A-3’. Эти праймеры расширяют 211 - фрагмент пары оснований 16S гена рибосомной РНК M. synoviae.
Молекулярная эпидемиология.
ДНК полученный из двух изолятов из полевого исследования 1 (SP2005-00257 A (ферма 1) и SP2005-00255 B (ферма 3)), из живых изолятов из полевого исследования 2 (два изолята от птиц, не получавших лечения, вскрытие которых было произведено на 7 неделе (SP2007-00333-3 and SP2007-00333-4), два изолята от птиц, получавших лечение, вскрытие которых было произведено на 7 неделе (SP2007-00333-14 and SP2007-00333-15) и один изолят от птицы из группы контроля, которая не несла яиц с нарушениями (SP2007-00426-1), и от двух изолятов от исследования с экспериментальным заражением (SP2007-00597-15 and SP2007-00601-24), были использованы для молекулярного типирования полиморфизма длин аплифицированных фрагментов (AFLP) (Feberwee и другие., 2006). Дополнительно, ДНК изолятов M. synoviae с двух других ферм, которые не были включены в другие исследования, но на которых куры несли яйца с EAA (SP2002-00804 and SP2007-01054) и четыре эталонных образца были исследованы. Использовались эталонные штаммы M. synoviae ATCC 25204 (M1996.01), K870 (M2001.29), K1968 (M2001.27) и Куриный/NL/Dec/801979Rob/00 ((M2000.05) (Feberwee и другие., 2004; 2006). ДНК концентрации для анализа AFLP были от 4 до 15 нг/л. Расщепление НindIII и HhaI, лигирование AFLP адаптеров и амплификация модифицированных фрагментов было выполнено как описано ранее Feberwee и другими (2006). Сайт-специфичные адапторы были лигированы с расщеплением продуктов, и после предварительного отбора полимеразной цепной реакции амплификации была проведена избирательная полимеразная цепная реакция с использованием одного праймера с флуоресцентной меткой содержащим селективную последовательность. Конечный продукт был проанализирован на ДНК синтезаторе Applied Biosystems Avant 310. AFLP характер исчерченности был импортирован в Bionumerics 4.61 и были проведены сравнения используя метод групп пар без веса с со средними арифметическими значениями.
Оценка кладки яиц и их качества, и примерная оценка экономического воздействия.
Кладка была синхронизирована на 10:00 утра и все яйца, и яйца с нарушениями (включая разбитые/проломленные) оценивались ежедневно между 13:00 и 14:00.
Прочность скорлупы и качественные показатели (единицы ХАО и толщина белка) определялись по системе измерения качества яиц Futura версии 3/A (Futura-Werner Fu¨ rste Gbr, Lohne, Германия). Прочность скорлупы измерялась при помощи приспособления компрессии скорлупы (Futura 3/A, OQT-II) калибр высоты использовался для определения единиц ХАО, белок яйца и альбумин (Futura 3/A, FIE-A).
Экономическое воздействие EAA было оценено основываясь на среднем количестве яиц с EAA, потери производительности и потерь в связи с повреждением яиц с мягкой скорлупой, увеличения процента яиц пониженного качества и увеличения затрат на персонал в связи с необходимостью сортировки яиц и очистки оборудования от разбитого яйца.
Гистологическое обследование яйцевода.
Яйцевод кур несущих яйца с EAA (n=3) целиком и кур несших нормальные яйца (n=3) были получены для гистопатологического анализа. Яйцеводы были зафиксированы в 4% буферном формалине и помещены в парафин. Участки воронки, головчатая кость, зоны прохода между головчатой костью и перешейком, перешейка и матки были окрашены гематоксилином и эозином.
Сканирующая электронная микроскопия скорлупы.
Структура скорлупы двух яиц с ЕАА и двух нормальных яиц была исследована с использованием SEM. Образцы были погружены в Karnovsky fixative на срок более недели. После промывания 0.1 M какодилатным буфером (pH 7.4), они были закреплены в 2% осмия тетроксида, буферизованного 0.1 M какодилатом (pH 7.4), в течение 2 ч. Образцы за тем были промыты в 0.1 M какодилате в течение 10 минут и за тем шесть раз в дистиллированной воде в течение 30 минут. За тем они были инкубированы в течение одного часа в 2% танине и снова шесть раз промыты дистиллированной водой. Образцы скорлупы за тем были зафиксированы в 2% OsO4 в 0.1 M какодилатном буфере pH 7.4 в течение 1 часа и промыты дистиллированной водой три раза в течение 20 минут. Образцы были обезвожены в ацетоне ступенчато изменяющейся концентрации (50%, 70%, 80%, 96% и 100%), проводя как минимум по 30 минут в каждой концентрации ацетона. В завершение образцы были высушены до критической точки в углекислоте (CPD 030 GRE; Bal-Tec AG, Balzers, Liechtenstein) согласно инструкции производителя и покрыты платиной толщиной примерно 10 нм перед исследованием на сканирующем электронном микроскопе (SEM) (XL30 SFEG; Fei Company, Эиндховен, Нидерланды). Толщина затвердевшего слоя была измерена с помощью системы формирования изображения сканирующим электронным микроскопом (SEM) основываясь на анализе Analysis 5 от Olympus Soft Imaging Systems (www.soft-imaging.net; Soft Imaging System, Мюнстер, Германия). Толщина затвердевшей скорлупы верхушки двух яиц с EAA (одно от полевого исследования 2 и одно от исследования с экспериментальным заражением) и двух нормальных яиц (одно от полевого исследования 2 и одно от исследования с экспериментальным заражением) были измерены в шести или семи местах в шести различных частях каждого яйца.
Статистический анализ.
Процент сыворотки, в которой определялись антитела к M. synoviae процент культур яйцеводов из которых выросли микоплазмы были сопоставлены, используя тест двустороннего критерия (Statistix®, 2005). IBV титры антител, замеры качества яиц, вес яиц, производство яиц, производство яиц с EAA и толщина затвердевшей скорлупы были проанализированы односторонним дисперсионным анализом Kruskal-Wallis. Kruskal-Wallis тест сравнительного попарного анализа был выполнен как анализ проведенный после с целью определения всех возможных парных различий между средствами лечения различных групп (Statistix®, 2005).
Результаты:
Полевое исследование 1.
M. synoviae было получено только из яйцеводов птиц, откладывающих яйца с EAA или от птиц из стай, которые откладывали яйца с EAA, но не из контрольных стай* хотя во всех группах были птицы с определяемыми антителами к M. synoviae (Таблица 1).
Таблица 1. Серология и выращивание микоплазмы яйцеводов кур с ферм, на которых откладывались яйца с EAA и ферм, где откладывались нормальные яйца.
| Номер фермы | Число исследованных птиц | Антитела к M. synoviae |
bЯйцевод положительный по культуре микоплазмы | |
|---|---|---|---|---|
| Откладывающие яйца с ЕАА | 1 | 3 | 1 | 1 |
| 2 | 6 | 6 | 1 | |
| 3 | 3 | 1 | 2 | |
| Откладывающие нормальные яйца | 4 | 5 | 5 | 0 |
| 5 | 5 | 3 | 0 | |
| 6 | 5 | 5 | 0 |
b Культура микоплазмы определена как M. synoviae при помощи полимеразной цепной реакции.
При посмертном вскрытии не было обнаружено макроскопических нарушений , кроме кистозной дегенерации правого яйцевода у некоторых птиц.
Полевое исследование 2 (проба лечения).
В обеих группах, откладывающих яйца с ЕАА, и откладывающие только нормальные яйца, были куры с сывороточными антителами против M. synoviae. При вскрытии после смерти на 4 неделе, большое число микоплазм было выделено из яйцевода 7/10 кур получающих лечение и 8/10 кур, не получающих лечения, несущих яйца с EAA. В конце эксперимента микоплазмы были выделены из 9/10 птиц, получающих лечение и 9/10 птиц, не получающих лечения (Таблица 2). Микоплазмы выделенные из яйцеводов были идентифицированы как M. synoviae с помощью полимеразной цепной реакции. M. synoviae был выделен из яйцеводов 2/10 птиц, несущих нормальные яйца в стае несущей яйца с EAA, но не из яйцеводов девяти птиц с фермы, на которой не откладывались яйца с EAA. Никакие другие бактерии не были выделены из яйцеводов.
Все птицы при длительном повторном обследовании производили яйца с EAA, в большинстве случаев. В некоторых случаях, также наблюдались яйца с мягкой скорлупой. Через несколько дней после дозы антибиотика производство яиц с EAA прекратилось, но снова появилось примерно через 12 дней (Рисунок 1). Тест компрессии яиц показал значительное снижение средней прочности скорлупы (P<0.05) у яиц с нарушениями (15.9+/-2.2 N, n=15) по сравнению с нормальными яйцами (34.1+/-1.7 N, n=20).
После лечения антибиотиками, скорлупа, временно, стала более прочной.
Через неделю после проведения лечения прочность скорлупы составляла 30.4+/-3.0 N (n=13). Значительного изменения среднего показателя XAO или толщины белка, у яиц с нарушениями и у нормальных яиц не наблюдалось (Tаблица 2).
При посмертном вскрытии не было обнаружено макроскопических нарушений ни у птиц с фермы, где откладывались яйца с EAA ни у птиц с контрольной фермы.
Особенности нарушений верхней части скорлупы и оценка экономического воздействия.
EAA характеризуется изменением поверхности скорлупы,. Утончением скорлупы, повышением прозрачности, и присутствием трещин и проломов (Рисунок 2). Нарушения скорлупы были ограничены областью примерно 2 см от верхушки яйца, и в большинстве случаев, эта область была четко выделена. (Рисунок 2). Рассчитанные средние экономические потери от стаи, в которой 5% яиц были с EAA, в возрасте от 30 до 75 недель составляли 3% от валовой прибыли от цены яиц.
Исследование с экспериментальным заражением.
Не было обнаружено антител против птичьего гриппа, EDS аденовируса, M. gallisepticum или M. synoviae в стае происхождения на 7 неделе. Клинических признаков болезни не наблюдалось ни в одной из экспериментальных групп во время всего исследования. Антитела против M. synoviae были обнаружены только у птиц, которые были заражены M. synoviae (Tаблица 3). В обеих группах зараженных IBV были обнаружены антитела HI против IBV, в то время как у других групп их не было.
M. synoviae не мог быть выделен из яйцеводов птиц из контрольной группы или птиц из группы зараженной внутривенно M. synoviae.
Тем не менее, микоплазмы были выделены из яйцевода одной несушки из группы зараженной внутривенно M. synoviae/IBV, шести из группы зараженной через трахею M. synoviae и семь из группы зараженной M. synoviae/IBV через трахею. Это были те группы, которые несли яйца с EAA.
Таблица 2. Измерение качества яиц, серология микоплазмы и и выращивание микоплазмы яйцеводов из полевого исследования 2 (проба лечения)
| Неделя | Ферма, где откладывались яйца с ЕАА | Контрольная ферма | ||
|---|---|---|---|---|
| Куры не получающие лечения, несущие яйца с ЕАА | Куры получающие лечение, несущие яйца с ЕААа | Куры несущие нормальные яйца | ||
| M. synoviae RPA тест b,с | 0 | 20/20 А | 20/20 А А | - |
| 3 | - | - | - | |
| 4 | 10/10 А | 8/10 А | - | |
| 7 | 10/10 А | 10/10 А | 9/10 А | |
| Выращивание микоплазмы яйцевода b, е | 4 | 8/10 А | 7/10 А | - |
| 7 | 9/10 А | 9/10 А | 2/10 В | |
| Прочность скорлупы (N) (n=10 до 20) d | 3 | 15.9 (2.2) А | - | - |
| 4 | 14.4 (3.2) А | 30.4 (3.0) В | - | |
| 7 | 16.2 (1.8) А | 13.9 (1.8) А | - | |
| Единицы XAO (n=12 до 20) d | 3 | 90.1 (1.2) А | - | - |
| 4 | 85.1 (2.3) А | 82.5 (1.2) А | - | |
| 7 | 74.2 (5.3) А | 81.2 (2.0) А | - | |
| Толщина белка (мм) (n=10 до 20) d | 3 | 8.4 (0.3) А | - | - |
| 4 | 7.4 (0.4) А | 6.9 (0.2) А | - | |
| 7 | 6.4 (0.4) А | 6.9 (0.3) А | - | |
a Птицы получающие лечение, получили разовую дозу окситетрациклина длительного действия через три недели.
b Тест двустороннего критерия.
c Агглютинация при разведении ≥ 1:8 считалась положительной.
d Cреднее (+/- стандартная средняя погрешность) и статистический анализ с Kruskal-Wallis одностороннего дисперсионного анализа.
е От двух до пяти положительных культур микоплазмы были протестированы при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) и идентифицированы как M. synoviae.
Процент выделения микоплазмы из яйцеводов птиц зараженных через трахею M. synoviae/IBV (7/17) был значительно выше (P<0.05) чем в контрольной группе (0/12), группе зараженной внутривенно M. synoviae (0/17) и группе зараженной внутривенно M. synoviae/IBV (1/16), но не отличалось значительно от процента выделения в группе зараженной M. synoviae через трахею (6/17). Процент выделения микоплазмы из яйцеводов птиц зараженных M. synoviae через трахею незначительно отличалось (P=0.0563) от процента выделения в контрольной группе, но значительно отличалось (P<0.05) от процента выделения у птиц зараженных M. synoviae внутривенно (Tаблица 3).
Средний вес в группах отличался незначительно в день 0. На 11 неделе, среднее увеличение массы тела, в группе зараженной M. synoviae/IBV внутривенно (368+/-18г) и зараженной через трахею M. synoviae/IBV (372+/-20г) было значительно ниже, чем в контрольной группе (474+/-20г) и группе зараженной M. synoviae через трахею (486+/-28г) (Taблица 3). Тем не менее, значительной разницы между увеличением веса в группе зараженной внутривенно M. synoviae (384+/-21г) и другими группами не наблюдалось.
Среднее дневное производство яиц на курицу было значительно ниже в группе зараженной M. synoviae через трахею (0.49+/-0.02 яиц) чем у большинства других групп: 0.75+/-0.02 яиц в контрольной группе, 0.61+/-0.03 яйца в группе зараженной M. synoviae внутривенно и 0.62+/-0.03 яиц в группе зараженной M. synoviae/ IBV внутривенно. Исключение составляли птицы из группы зараженной M. synoviae/IBV через трахею (0.54+/-0.03 яиц) (Таблица 3).
Таблица 2. 2a: Нарушение скорлупы в верхней части яйца характеризуется изменением поверхности, истончением скорлупы, увеличением прозрачности, и появлением трещин и проломов. Патология скорлупы ограничена областью примерно 2 см2 в верхней части яйца.
На рисунке видны яйца от белых и коричневых несушек.
2b: четкое обозначение границы между поврежденной и нормальной скорлупой более отчетливо видно при просвечивании.
Ненормальная скорлупа более прозрачна.
Рисунок 1:
Общее число производимых яиц с ЕАА в полевом исследовании 2. Числа в рамке (от 21 до 40) указывают число кур, получивших окситетрациклин длительного действия в 25 день. Замечено временное производство нормальных яиц в течение 12 дней (с 28 по 40 дни) после приема антибиотика.
Яйца с EAA производились птицами, зараженными внутривенно M. synoviae/IBV (15/778, 2%), птицами зараженными M. synoviae через трахею (49/685, 7%) и птицами, зараженными M. synoviae/IBV через трахею (96/673,14%). Производство яиц с EAA началось в дни 37, 26 и 23 после инокуляции M. synoviae в этих группах, соответственно (Рисунок 3).
Средний процент производства яиц с EAA был значительно выше у птиц с M. synoviae/IBV зараженных через трахею (0.10+/-0.01 яиц/курицу/день) чем в группе, зараженной M. synoviae через трахею (0.06+/-0.01 яиц/курицу/день) и в группе, зараженной M. synoviae/IBV внутривенно (0.02+/-0.00 яиц/курицу /день).
На неделе 4 и 5, испытания яиц на сжатие показали значительное (P<0.05) уменьшение средней прочности скорлупы у поврежденных яиц (16.8+/-0.9 N, n=60) по сравнению с нормальными яйцами из контрольной группы (37.7+/-15N, n=60) и нормальных яиц из всех групп вместе взятых (M. synoviae внутривенно., M. synoviae через трахею и M. synoviae/ IBV через трахею 37.7+/-1.4N, n=60). На 9 и 11 неделе значительное различие также наблюдалось в прочности скорлупы яиц с отклонениями (12.7+/-1.0 N, n=30) по сравнению с яйцами из контрольной группы (31.7+/-1.8 N) и нормальными яйцами из зараженных групп (M. synoviae внутривенно, 35.1+/-1.8 N; M. synoviae /IBV внутривенно, 35.2+/-2.0 N; M. synoviae через трахею,35.6+/-1.6 N; и M. synoviae/IBV через трахею, 37.2+/-1.6 N).
При посмертном вскрытии, проведенном в 9:00 и 10:00 утра, не было обнаружено макроскопических аномалий в яйцеводе.
У от 83% до 94% птиц в каждой группе яйцо находилось в матке. Яйца с EAA были обнаружены у одной птицы зараженной через трахею M. synoviae и у трех птиц зараженных M. synoviae /IBV внутривенно.
Рисунок 2. Нарушение скорлупы в верхней части характеризуется изменением поверхности скорлупы, утончением скорлупы, повышением прозрачности, и присутствием трещин и проломов. Нарушения скорлупы были ограничены областью примерно 2 см от верхушки яйца, и в большинстве случаев, эта область была четко выделена.
На фотографии яйца от белых и коричневых несушек.
Таблица 3. Серология, разведение микоплазмы яйцевода, рост, прочность скорлупы, производство яиц и производство яиц с EAA при исследовании с экспериментальным заражением.
| Неделя | Контроль | M. synoviae внутривенно | M. synoviae внутривенно + IBV | M. synoviae через трахею | M. synoviae через трахею +IBV | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| n Среднее IBV HI титра | 0 | 12 - |
18 - |
17 4.4 (0.2) А |
18 - |
17 4.4 (0.2) А |
| 4 | 4.5 (0.2) А | 3.6 (0.3) А | 7.1 (0.3) В | 4.9 (0.3) А | 7.1 (0.3) А | |
| 8 | 4.5 (0.3) А | 4.8 (0.2) А | 6.9 (0.3) В | 3.9 (0.1) А | 7.8 (0.4) В | |
| 11 | 4.4 (0.1) А | 4.1 (0.1) А | 6.8 (0.2) В | 4.2 (0.3) А | 7.4 (0.4) В | |
| M. synoviae RPA положительный тест b,c | 0 | 0/12 A | 0/18 А | 0/17 А | 0/18 А | 0/17 А |
| 4 | 0/12 А | 15/18 В | 12/17 В | 14/18 В | 12/17 В | |
| 8 | 0/12 А | 17/17 В, F | 17/17 В | 17/17 B,F | 13/17 В | |
| 11 | 0/12 А | 13/17 В | 13/16 B,F | 15/17 В | 11/17 В | |
| Положительная культура Микоплазмы яйцевода b,d | 11 | 0/12 C,D | 0/17 C | 1/16 A,C | 6/17 A,B,D | 7/17 В |
| Вес (г) а | 0 | 1230 (19) А | 1248 (17) А | 1261 (14) А | 1261 (18) А | 1258 (18) А |
| Увеличение массы тела (г) а | 0 до 11 | 474 (20) А | 384 (21) А,В | 368 (18) В | 486 (28) А | 372 (20) В |
| Среднедневное производство яиц на курицу | 1 по 11 | 0,75 (0,02) А | 0.61 (0.03) В | 0.62 (0.03) В | 0.49 (0.02) С | 0.54 (0.03) В,С |
| Яиц с ЕАА | 4 по 11 | 0 | 0 | 15 | 49 | 96 |
| Среднее число яиц с ЕАА не курицу в день а | 4 по 11 | 0.0 (0.00) | 0.0 (0.00) | 0.02 (0.00) А | 0.06 (0.01) В | 0.1 (0.01) С |
| Прочность скорлупы (N) | ||||||
| Нормальные яйца (n=60 на группу) е | 4 по 5 | 37.7 (1.4) А | - | 38.2 (1.5) А | - | - |
| ЕАА яйца 3 групп (n=60) е | 4 по 5 | - | - | 16.8 (0.9) В | - | - |
| Нормальные яйца (n=30 на группу) е | 9 по 11 | 31.7 (1.8) А | 35.1 (1.8) А | 35.2 (2.0) А | 35.6 (1.6) А | 37.2 (1.6) А |
| ЕАА яйца 3 групп (n=30) е | 9 по 11 | - | - | 12.7 (1.0) В | - | - |
A Средний показатель (+/- стандартная погрешность) и статистический односторонний дисперсионный анализ Kruskal-Wallis.
B Тест двустороннего критерия.
C Aгглютинация при разведении ≥ 1:8 считалась положительной.
D Oт одной до двух положительных культур микоплазмы были протестированы при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) идентифицированы как M. synoviae.
E Средний показатель (+/- стандартная погрешность) и статистический односторонний дисперсионный анализ Kruskal-Wallis; средние показатели в пределах одного ряда и между рядами (не яйца с EAA и яйца с EAA) с одинаковыми буквами верхнего регистра не имеют значительных различий (P>0.05).
F Oдна птица умерла.
Рисунок 3. Производство яиц с EAA после экспериментального заражения. Яйца с EAA не производились контрольной группой и группой зараженной только M. synoviae внутривенно.
Яйцеводы этих трех птиц из группы зараженной M. synoviae/IBV через трахею также обнаружили положительную культуру микоплазмы.
Молекулярная эпидемиология.
Три различных кластера штаммов M. synoviae могли быть идентифицированы при помощи AFLP (Рисунок 4).
Кластер 1 содержал изолят с фермы 1 (SP2005-00257 A), изолят из поврежденных суставов (M2000.5) и эталонный штамм K1968 (M2001.27). Схемы образованные этими организмами имели более 89% сходства друг с другом. Кластер 2 содержал эталонный штамм K870 (M2001.29), и эта схема имела 75% сходства с Кластерами 1 и 3. Кластер 3 содержал две различных группы изолятов, одна включала инокулят (SP2005-00255 B), два полевых изолята (IP2007-01054 и IP2002-00804), изоляты полученные из яйцеводов во время проведения исследования с экспериментальным заражением (SP2007-00597-15 и SP2007-00601-24) и изоляты от птиц получающих лечение и от птиц не получающих лечение из полевого исследования 2 (SP2007-00333-3, SP2007-00333-4, SP2007-00333-14 и SP2007-00333-15). Вторая группа в кластере 3 включала изолят от курицы производящей нормальные яйца в полевом исследовании 2 (SP2007-00426-1) и ATCC штамм (M1996.01).
Схема, полученная по инокуляту на 88% сходна со схемой изолятов из яйцеводов птиц в исследовании с экспериментальным заражением.
Схема, полученная от всех повторных изолятов из яйцеводов ≥ 93% имели сходство друг с другом. Схемы, полученные от двух изолятов из кластера 3 из яйцеводов птиц из полевого исследования (SP2007-01054 и SP2002-00804) с ферм производящих яйца с EAA имели 88% сходства друг с другом. Схема, полученная от изолята из яйцевода курицы, несшей нормальные яйца в полевом исследовании 2 (SP2007-00426-1) имели 97% сходства с полученной от штамма ATCC (M1996.01) и 86% сходства с полученными от организмов из кластера, содержащего другие изоляты из яйцевода в этом полевом исследовании.
Гистологическое исследование яйцевода.
Гистологические повреждения не были обнаружены в яйцеводах птиц в исследовании с экспериментальным заражением.
Исследование скорлупы на сканирующем электронном микроскопе.
Анализ образцов скорлупы на сканирующем электронном микроскопе показал изменения в затвердевшем слое и внутреннем слое внутренних мембран яиц с EAA. Слой мембраны (Рисунок 5) отсутствовал в верхней части скорлупы, и палисадный слой был меньшей ширины. Внутренние мембраны были утолщены, вероятно в результате увеличения плотности сетчатой структуры белковой ткани (Рисунок 5).
Основная толщина затвердевшего слоя верхушки яйца с EAA из полевого исследования 2 (212+/-1.5 мм) была значительно (P<0.05) меньше чем у нормальных яиц (311+/-1.7 мм). Общая толщина скорлупы яйца с EAA из исследования с экспериментальным заражением также была значительно нижe чем у нормальных яиц (246.9+/-1.7 мм по сравнению с 286.7+/-1.7 мм).
Обсуждение:
EAA у столовых яиц, приводящее к значительному уменьшению прочности скорлупы, описаны здесь впервые. Патология скорлупы яйца была связана с учащением случаев мягкой скорлупы и пролома яиц, а также с общим снижением производстве яиц. Наши исследования качества скорлупы яиц показали, что прочность скорлупы была значительно снижена (в два раза по сравнению с нормальным яйцом), что сопровождалось прозрачностью определяемой невооруженным глазом, в особенности при просвечивании.
Исследование на сканирующем электронном микроскопе дало последующее объяснение уменьшения прочности скорлупы и прозрачности: верхняя часть скорлупы яиц с EAA не имела слоя маммилярных наростов и части палисадного слоя. Наблюдаются ли структурные изменения, обнаруженные в верхней части яйца, в других частях скорлупы пока не исследовано. Тем не менее, это представляется маловероятным, так как почти все яйца проламывались в верхней части, при осмотре, нарушение скорлупы было заметно, только в верхней части яйца.
В обоих полевых исследованиях наблюдалась связь между присутствием M. synoviae в яйцеводе и производством яиц с EAA. Эта зависимость была в дальнейшем подтверждена тем фактом, что нормальная прочность скорлупы временно восстанавливалась после лечения несушек окситетрациклином длительного действия. Нерегулярность связи между EAA и заражением M. synoviae была определена при экспериментальном заражении.
Рисунок 4. Дендрограмма полученная по методу безвесовых коэффициентов пар групп с арифметическими средними HindIII/HhaI схема анализа полиморфизма длины амплификационных фрагментов. Были включены штаммы и изоляты: из полевого исследованяи 1, SP2005-00257 A (Ферма1) и SP2005-00255 B (ферма 3, также иннокулят использованный для экспериментального заражения); из полевого исследования 2, SP2007-00333-3 (птица не получающая лечения), 00333-4 (птица не получающая лечения), 00333-14 (птица получающая лечение), 00333-15 (птица получающая лечение) и SP20007-00426-1 (птица несущая нормальные яйца); из исследования с экспериментальным заражением, SP2007-00597-15 и SP2007 00601-24; и два дополнительных полевых изолята, SP2002-00804 и SP2007-01054. Можно было идентифицировать три различные кластера штаммов M. synoviae. Изоляты M. synoviae из яйцеводов кур производящих яйца с EAA не были клональными. Штамм инокулят имел 88% сходство с повторными изолятами из яйцевода из эксперимента на животном. Изолят SP2007-00426-1 из полевого исследования 2 имел 85% сходства с другими изолятами из этого исследования.
Яйца с EAA производились всеми группами с M. synoviae, за исключением группы зараженной только M. synoviae внутривенно. Число яиц с EAA было самым высоким в группе зараженной через трахею M. synoviae /IBV. Птицы в этой группе зараженной внутривенно M. synoviae /IBV также имели самые низкие показатели роста. Число яиц на несушку было самым низким в группе зараженной через трахею M. synoviae и в группе, зараженной M. synoviae./IBV через трахею. Общее производство яиц и производство яиц с EAA могло быть недооценено из за большей склонности яиц с аномалиями к разбиванию, что приводило к некоторым потерям до ежедневного сбора яиц.
Синергия, наблюдающаяся между M. synoviae и IBV была неожиданной, так как она ранее наблюдалась в патогенезе артрита (Landman & Feberwee, 2004) и респираторных заболеваний вызванных M. synoviae (Kleven et al., 1972; Springer и другие., 1974; Hopkins & Yoder, 1982). Штамм IBV использованный в этом исследовании вводился несушкам в предыдущих исследованих, но это никогда не вызывало производства яиц с EAA (J.J. de Wit, неопубликованные данные). Производство яиц с EAA началось через три недели после инокуляции M. synoviae, такой же инкубационный период, как и в исследовании с M. synoviae и артритом (Landman & Feberwee, 2001, 2004). Стоит отметить, что M. synoviae вызывала или нет ЕАА в зависимости от способа заражения, заражение через трахею было самым эффективным. Микоплазмы могут перемещаться из колонизированного воздушного мешка в расположенный рядом яичник (Roberts & McDaniel, 1967). Приведенные здесь результаты исследования указывают на то, что перемещение M. synoviae из воздушного мешка в яйцевод более эффективно, чем колонизация яйцевода через систему кровообращения.
Предрасполагающий фактор, влияющий на яйцевод, такой как заражение IBV, может быть необходим чтобы вызвать заселение яйцевода бактериями при внутривенном заражении (Cavanagh & Naqi, 2003). Другие исследователи установили, что путь заражения M. synoviae оказывает действие на патогенность. Инокуляция через корм или внутривенно скорее всего вызовет синовит, в то время как эти повреждения встречаются реже после респираторного воздействия (Lockaby и другие.,1998; Landman & Feberwee, 2004). Заражение IBV также увеличивает склонность к патологии суставов после опрыскивания M. synoviae (Landman & Feberwee, 2004). Сравнение изолятов M. synoviae при помощи анализа полиморфизма длины амплификационных фрагментов показало, что изоляты из яйцеводов могли быть отнесены к двум различным кластерам штаммов, что указывает на то, что не являлись клональными. Сходство между штаммами, использованными для экспериментального заражения и повторного выделения изолятов из яйцеводов составило 88%. Как правило изоляты со сходством 90% или более, считаются идентичными. Тем не менее, инокулированный штамм все равно может считаться одинаковым с повторно полученными из яйцевода штаммом, так как Feberwee и другие (2005) показали, что вариации внутри стаи могут наблюдаться (сходство на 85% наблюдалось у разных изолятов от одной стаи), что указывает на то, что генетические изменения могут произойти за время развития инфекции. Значительные изменения в vlhA локусе возможны из-за сайт-специфической рекомбинации (Noormohammadi и другие, 2000) и возможно, что это изменение вызывает некоторую гетерогенность в AFLP схемах одного клона. Отсутствие клональности указывает на то, что новый тропизм ткани связанный с ЕАА объясняется обычным фактором вирулентности или обычным предрасполагающим фактором. Хотя M. synoviae был выделен в больших количествах из яйцеводов, это не было связано с гистологически определимыми нарушениями яйцевода. Тем не менее, дефекты яичной скорлупы, располагающиеся в основном в маммиллярном слое затвердевшей части, могут быть вызваны функциональными и/или ультраструктурными дефектами яйцевода. Не совсем понятно как M. synoviae воздействует на нормальный процесс затвердения скорлупы, или почему повреждения располагаются в верхней части яйца.
M. synoviae может воздействовать на состав и концентрацию матрицы протеинов скорлупы в утробной жидкости необходимых для роста кальцита во время затвердения яйца (Gautron и другие., 1997; Hincke и другие.,1999, 2003). M. synoviae может также воздействовать на ресничное движение в яйцеводе, что может привести к изменениям в составе утробной жидкости действующем на отложение кристаллов карбоната кальция (Dominquez-Vera и другие., 2000). Периферийная колонизация отдельной части матки может также объяснять ограниченность дефектов скорлупы определенным участком.
Лечение при помощи окситетрациклина имело значительное влияние на прочность скорлупы, но это действие было только временным, наблюдение, которое в согласии с другими исследованиями указывает на то что противомикробная терапия не уничтожает M. synoviae в зараженных стаях (Kleven, 2003). Ограниченная польза от противомикробной терапии и риск остатков в яйцах, указывает на необходимость разработки альтернативных способов решения проблемы, таких как вакцинация или искоренение заболевания, для контроля EAA вызываемого M. synoviae.
Рисунок 5. 5a: изображение, полученное при сканировании на сканирующем электронном микроскопе (SEM) нормальной скорлупы, показывающее внутренние мембраны (A), маммилярный слой (B) и часть палисадного слоя (C). Bar=50 мм. 5b: изображение, полученное при сканировании на сканирующем электронном микроскопе (SEM) скорлупы с нарушениями. Маммилярный слой отсутствует, а палисадный слой присутствует только частично: внутренние мембраны (A), палисадный слой (B), вертикальный слой (стрелка) и кутикула (острие стрелки). Также надо обратить внимание на повышенную плотность внутренних мембран. Bar=100мм.
Хотя респираторные инфекции M. synoviae как правило считаются бессимптомными (Van Eck и другие.,1980), число отчетов об экономических потерях, связанных с респираторными заболеваниями (Morrow et al., 1990; Lockaby и другие., 1998; Kang и другие., 2002) и артропатических деформациях (Landman & Feberwee,2001; van Beek и другие., 2002; Kleven, 2003) увеличилось. Патология скорлупы, описанная здесь и сопутствующие потери при производстве яиц, подчеркивают экономическое значение M. synoviae в коммерческом птицеводстве.